2023年8月29日四川大学生命科学学院张阳教授团队在Nature Communications上发表了一篇名为"Understanding the mechanism of red lightinduced melatonin biosynthesis facilitates the engineering of melatonin-enriched tomatoes" 的研究论文。该研究对番茄果实褪黑素的合成途径进行了全面的阐明，对其生物合成相关基因(SlSNAT、SlASMT5、SlASMT7和SlCOMT2)进行功能鉴定。发现红光处理通过SlphyB2-SlPIF4-SlCOMT2模块显著促进了番茄果实褪黑素的合成，并对SlCOMT2启动子中PIF4的结合基序设计了基因编辑策略，显著提高了番茄果实褪黑素的含量。

背景

褪黑素是一种吲哚胺化合物，存在于从植物到动物的所有生物体中。在植物中，褪黑素主要起促进生长和抗氧化的作用。它具有延缓衰老，增强抵抗力的作用。提高番茄果实褪黑素含量可改善番茄果实的营养和农艺性状。目前研究发现，植物体内至少有四种可能的褪黑素合成途径，其中的关键酶包括色氨酸脱羧酶(TDC)，色氨酸-5-羟化酶(T5H)，5-羟色胺- n-乙酰基转移酶(SNAT)和n-乙酰-5-羟色胺-甲基转移酶(ASMT)/咖啡酸-o-甲基转移酶(COMT)。研究发现番茄中至少有5个TDC候选基因，这些基因可能在植物生长发育或抗逆过程中发挥不同的作用。然而，褪黑素的完整生物合成途径，尤其是在番茄果实中的褪黑素合成途径，目前尚不清楚。

此外，有研究表明植物褪黑素的合成和信号传递还受到环境因子(如光和温度)的显著影响。通过光信号调节褪黑素的合成已经在动物身上得到了充分的研究。然而，在植物中的研究相对滞后。不同的光信号如何协调褪黑素的合成和代谢还不清楚。此文章通过鉴定参与番茄果实褪黑素的合成途径的相关基因，阐明番茄褪黑素的完整生物合成途径，对番茄关键生物合成相关基因进行基因编辑，从而实现了有效的番茄代谢工程调控。

结果

01

番茄果实褪黑素生物合成相关基因的筛选

为阐明番茄褪黑素的完整生物合成途径，作者通过对番茄基因组进行了BLAST搜索以及进一步的相关性和定量分析(图2)，鉴定出10个在番茄果实中的候选基因。之后将10个候选基因在烟草叶片中瞬时转染和在番茄果实中沉默，检测褪黑素的含量。瞬时表达SlASMT5(Solyc03g097700),SlASMT7(Solyc06g064500),SlCOMT2(Solyc10g85830)和SlSNAT(Solyc10g074910)可显著诱导烟草叶片褪黑素的产生，而基因的沉默显著降低了番茄果实中褪黑素的含量(图1c，图5)。这些结果表明SlSNAT、SlCOMT2、SlASMT5和SlASMT7参与褪黑素的生物合成。

02

SlSNAT、SlCOMT2和SlASMT5/7在

褪黑素生物合成中的功能验证

作者定量测定了SlASMT5、SlASMT7、SlCOMT2和SlSNAT在不同组织中的表达水平，结果表明：SlSNAT在所有测试组织中均有表达，而SlASMT7、SlASMT5和SlCOMT2主要在破色期后的果实中表达。之后作者生成了SlASMT5、SlASMT7、SlCOMT2和SlSNAT的稳定过表达和RNAi植株(图2)。与WT果实相比，这四个基因的过表达均显著提高了褪黑素的产生，而这些基因的沉默则降低了褪黑素的含量(图2a)。此外，作者通过体外酶活分析实验证实，番茄果实中褪黑素的生物合成可能有两种途径，一种是通过N-乙酰羟色胺途径，另一种是通过5-甲氧基色胺途径。进一步的实验证明SlASMT5和SlCOMT2催化褪黑素生物合成的N-乙酰羟色胺，而SlASMT7参与5-甲氧基色胺途径(图2c)。

03

红光处理显著诱导番茄果实褪黑素的

生物合成

作者随后通过对番茄植株补充红光，发现其可以诱导SlASMT7、SlASMT5和SlCOMT2的表达，并且显著增加番茄果实成熟过程中褪黑素的含量(图3a)。补充红光显著增加了N -乙酰羟色胺的含量，但没有增加5-甲氧基色胺的含量(图3b)。因此结果表明红光诱导的褪黑素生物合成似乎依赖于通过SlCOMT2和SlASMT5激活N-乙酰羟色胺途径。

随后，作者对SlASMT7、SlASMT5和SlCOMT2RNAi系重复了红光补充实验。与WT相比，RNAi-SlASMT5和RNAi-SlCOMT2系在红光照射下的果实褪黑素含量明显降低，而RNAi-SlASMT7系对红光处理仍有良好的反应(图3c)。这些数据表明，补充红光可以通过激活SlASMT5和SlCOMT2的表达水平来促进番茄果实褪黑素的生物合成。

04

SlPIF4直接抑制SlCOMT2的表达，抑制

番茄果实中褪黑素的生物合成

为了研究红光诱导褪黑素生物合成的分子机制，作者在SlASMT5和SlCOMT2的启动子区域找到光信号相关的G-box元件(图4a)并通过酵母文库筛选鉴定出一个与光敏色素相互作用因子4(SlPIF4)，它能与proSlCOMT2和proSlASMT5结合。进一步的酵母单杂实验表明，SlPIF4可以结合到SlCOMT2启动子的P2元件上(图4b)，随后的双荧光素酶和EMSA实验表明SlPIF4通过与proSlCOMT2的P2位点相互作用来抑制SlCOMT2的表达(图4e)。SlPIF4是褪黑素生物合成的负调控因子，参与了红光介导的褪黑素生物合成调控。

05

SlphyB2-SlPIF4-SlCOMT2模块介导

番茄果实中红光诱导的褪黑素生物合成

作者对番茄原生质体进行了双荧光素酶报告基因检测实验，发现SlPIF4可以结合自身启动子实现自激活。单独使用SlphyB2可以抑制SlPIF4的自激活(图5a)。萤火虫荧光素酶互补成像实验表明SlphyB2可能促进SlPIF4的降解(图5b，5c）。之后作者在WT和RNAi-SlPHYB2番茄果实中瞬时表达flag标记的SlPIF4，结果表明SlphyB2可以通过26s蛋白酶体途径调节SlPIF4的稳定性(图5d）。因此，在RNAi-SlPHYB2细胞系中，SlCOMT2表达水平被抑制，褪黑素含量显著降低，红光处理不再有效(图5e, f）。

综上所述，SlPIF4通过直接抑制SlCOMT2表达负向调节番茄果实中褪黑素的生物合成。在红光补充下，SlphyB2的激活通过26s蛋白酶体途径促进SlPIF4的降解。因此，释放对SlCOMT2表达的抑制，增强褪黑素的生物合成(图6)。

06

培育富含褪黑素的番茄

为了测试这种调节机制是否可以用于培育褪黑素分泌增强的番茄品种，作者设计了两种基因编辑策略。一种策略是直接敲除SlPIF4(图7a)，另一种策略是突变proSlCOMT2上的SlPIF4识别位点(图7b)。两种方法都显著增强了褪黑素的生成(图7c)。然而，在正常生长条件下，针对proSlCOMT2上SlPIF4识别位点的基因编辑可以诱导更强的褪黑素积累:与WT相比，两株CR-slpif4菌株(12和15)的褪黑素含量增加了约3倍。然而，两株CR-proSlCOMT2菌株(5和8)的褪黑素含量分别增加了8.75倍和12.64倍(图7c)。

总结

本文阐明了番茄果实褪黑素的完整生物合成途径，还揭示了红光诱导褪黑素生物合成的机制，并通过基因编辑成功培育出富含褪黑素的番茄品种。本文的研究结果不仅扩展了目前关于环境因素如何影响关键代谢物的生物合成的知识广度，而且为如何了解环境因素调控关键代谢过程的机制以及培育营养丰富的作物提供了研究范例。

评论人：彭民月

校对：吕进航、侯豫康

编辑：王增