因为身穷志坚，我觉得很有必要好好研究一下穷人能发什么样的文章。这是我特意选的一篇分钱比很高的文章。

这篇文章2018年发表在J Pineal Res上，作者来自瑞士苏黎世大学医院外科学系肝胆胰与移植中心。

J Pineal Res，这好似看上去是个野鸡杂志，其实不然，这可是15.221分的一区杂志... 不过它的确有一些奇特。Pineal这个词的意思是松果体，所以...

这个《松果体研究杂志》，果然，刊登的都是褪黑素相关的研究....这还真是...

褪黑素，好像有挺多妹子都喜欢用这个玩意？可能这是这些妹子白的原因？也是这些妹子上课直点头的原因？反正，大家吃这个药吃的那么开心，或多或少可能也有这杂志的功劳...（笑而不语

本文也是做的这个褪黑素（melatonin, MLT）的治疗学研究，标题是：

本文，是一个剧情上非常非常简单的文。它就是一个标准的治疗学文章。不过，褪黑素这种烂大街的玩意，肝脏缺灌这种烂大街的模型，意味着肯定很早就有人试过了。果不其然，用Pubmed搜一下：

这...太尴尬了。要是一般人，肯定想，算le算le，爷本来想灌个水，不料给捷足先登了，赶紧考虑考虑换下一个，白藜芦醇怎么样？姜黄素？人参？双黄连？

作者就另辟蹊径，换一个类似但又不同的模型来试试看，你们这些水货肯定完全想不到还可以打一个擦边球，哈哈。

作者换的模型是：小肝综合征（SFSS），看上去很高级，没见过一样，其实和缺灌损伤有藕断丝连的关系。

这个SFSS，全称是small-for-size syndrome，大概意思指的是移植术后肝脏太小了，不够用了，引发的一系列肝功能不全等问题。

当然了，其实SFSS并不是小了这么简单。首先，这个情况并不一定是移植术，肝切除术切的太多了也可能。其次，对于移植术而言，除了供受体体格相差巨大引起小肝综合征外，还有一种重要的情景，就是活体肝移植。毕竟为了保障供体的存活，切下来的肝脏不可能太大，这够不够受体使用就成为问题。此外还有可能是因为供肝存在较为严重的损伤，例如本身就有脂肪变等基础病，再加上不可避免的缺灌损伤、排斥反应等，诱发或加剧小肝带来的问题，最终表现为SFSS。

其次，SFSS的发生发展中，体积太小或受损太重并不是唯一原因，还有其他很重要的机制，例如本来供应全肝的门脉血，现在全部的流量都集中在这个小新肝上，必然带来的负荷过重，进一步引起损伤，而这负荷，除了物理上的门脉血过度灌注，也有生物上的代谢紊乱、肝功能过载，引起肝脏微循环的崩坏，引发和加剧肝细胞功能紊乱、再生不良，最终表现为肝衰竭、引致死亡。

因此总之，SFSS背景下研究缺灌损伤，并不是想象中的只是缩小版的缺灌，还是有它特别之处的，完全可以算是一种新的circumstance，也可以独立成文。何况，SFSS是一个很重要的话题——它对于肝移植特别是在东方文化国家运用广泛的活体肝移植来说是一个非常严峻的挑战。试想一下，妈妈为了孩子捐献了部分肝脏，结果仍不够用，这不惨吗？

那么，作者是如何造模的呢？

这个其实也不是那么简单的。倒并不是说造模要花很多钱，但是的确要一定的外科操作水平。作者硬是靠手艺把小鼠分出了3对处理：

（1）小肝缺灌，记作IR+PH，PH指的是部分肝切除。操作如下图：首先把小一点的肝叶血流扎住，60min后复灌的同时把刚刚没扎的肝脏切掉。这组比较稳健，可以得出不少数据。

（2）更小肝缺灌，记作IR+exPH，ex指extanded，操作类似于上面的，不过采取扩大切除，剩的肝更小。这组会死不少动物，因此主要是用来做生存的。

（3）小肝移植，记作SFS-LT。这就完全是仿真的肝移植了，切下供体肝脏的一叶（当然会比上面的组稍微大一点），而后经过灌洗、冷藏，再移植给受体。这组也比较容易死，因此结局指标也是生存。

（这些图都是原文里的。所以说，医科大学有一个美术系是多么重要的事情...）

这三对分组设计，逐渐深入，一个一个做一篇文章就结束了...检验指标无非就是三个方面：肝损、炎症、再生增殖水平（这个是SFSS较特有的指标）。

当然，作者发的好歹是10分+的文章，为了严谨的论证，作者还搬出了两个反证方法：

既然用的是褪黑素取得了表型，那就搬出褪黑素受体拮抗剂Luzindole。

既然认为IL-6对肝脏再生很重要，文章也发现了IL-6通路存在激活，就搬出IL-6敲除鼠+外源性IL-6补充rescue证一把；或者是拿出IL-6通路抑制剂来证一把。

下面我们详细的看一下。

Fig1

首先作者拿出IR+PH这个处理方法。这个方法比较稳，鼠也不太容易死，容易获得比较好的结果，但是并不能很好的类比SFSS的情况。作者拿它先取一个合适的褪黑素处理剂量，以及得一波比较稳定的表型结果。

首先是剂量摸索，如图B，作者试了0.08 0.4 2 10mg/kg，并以其1 6 24h肝酶水平衡量损伤情况，最终选取了10mg/kg。另外要注意，本文中MLT的运用默认是术前15min和复灌后st，方法都是i.p.。这...这难道意思不是打了两针共是20mg/kg吗...

总之这个剂量选择并不是非常严谨...不管了，反正作者把样子做出来就行了...

而且这个剂量其实挺大的...我看了一下网上卖的褪黑素，好多标500mg/片...这怎么可能...这样吃的话那些小姐姐可能要变成姨妈不调的睡美人了...标的500mg每片可能是指一个药片重500mg...虽然这本质上就是诈骗。其实每片药的含量也就几毫克，例如在欧盟作为处方药使用的Circadin就是2mg缓释片，而乱七八糟的保健品剂量也不会超过10mg每片...所以如果按本文10mg/kg的剂量，恐怕要好几瓶。不过，无毒害的话临床意义还是很大的。

如图C，以24h为重点，10mg/kg为剂量，试了拮抗剂的效果，不管好像并不很拮抗。作者据此得出结论，认为可能褪黑素的有关作用不是褪黑素受体依赖的。这...咱喝5瓶敌敌畏立马再打几针解磷定好像也不行，难道解磷定的作用独立于胆碱酯酶通路吗？这个结论得出的有些草率了。

Fig2

还是这个模型，把具体的表型都交代了。

首先还是肝酶的时间序列，全程评估褪黑素（MLT）疗效。

其次是肝细胞损伤的marker，DAMPs的一种：HMGB1在24h时的表达、核定位情况以及时间序列表达情况。此外，作者还做了氧化应激导致DNA损伤的标志物γ-H2A.X，因为这个指标的发生比较早，就选3h作为观察窗。

最后是体外实验，肝细胞在4h缺氧的应激下，MLT处理可降低ALT AST表达（说实在的，体外实验还拿肝酶水平来作为指标的，估计是细胞层面的损害没啥表型...）

不过，作为一个肝损的模型，表型检验居然没有做组织学HE及评分...不是很能理解...

Fig3 Fig4

还是这个模型，把机制层面的一些结果交代了。

首先是炎症层面，因为文献指出IL-6 TNF-α是肝脏再生非常重要的细胞因子，（而且作者可能刚刚好有IL-6 KO鼠的资源可以利用），因此作者选择做这俩。

前人研究指出在肝IRI中，用褪黑素后TNF-α和IL-6下调。这还得了，作者说我不相信事情这么简单。果然，可能是SFSS的模型毕竟还是有些不一样或是怎么的，作者发现用褪黑素后TNF-α和IL-6上调（分别测了肝mRNA表达和血清水平）

（不得不说，本文的工作量真的大，这些指标动不动都是好几个时间点，这得养多少鼠 做多少鼠的手术 测多少次这些指标啊！当真是外科学系 开刀有如喝咖啡一样简单吗？其次，这文章的图，画质也太差了......）

其次是增殖水平。作者测定的是PCNA和pH3这两个比较经典的marker，这个的测定时间是术后48小时，也很好理解：这时候正是肝脏再生的高峰。

然后，因为IL-6 TNFα的增加肯定和免疫细胞有关，作者就开始做流式，取的是复灌后3h的样。发现MLT处理组有更多CD45+Ly6C+F4/80+单核细胞浸润。作者进一步在体外给予LPS刺激4h，观察IL-6 TNFα水平，如下图：

因为画质太差，大家可能开不太清。这个分组我是觉得有些不能理解，每张图6组数，分成左右各三，分别是原来有没有用过MLT。而后组内的变量则是4h的处理时间内，用的是空白、LPS还是MLT。这是为了证明什么呢？

其实，这是一个很有意义的问题。例如在IRI背景下，单核-巨噬细胞浸润带来的免疫反应通常被认为是有害的，但其也承载诸如IL-6这种对增殖再生非常重要的免疫反应，因此如何趋利避害成为重要话题。而MLT关闭免疫损害而开启有益免疫反应，实现了趋利避害，那它的机制又何在呢？

总之，还有很多可以探究；而像这种仅指出某个时点免疫细胞的高高低低做个characterization，这和前人拿MLT做标准IRI而后水一篇文章也没有什么差别。但咱的作者，这里只是提一下免疫细胞，划一下水...可能是他对免疫细胞不感兴趣或是不够专业，心想反正算了。

Fig5

这一段是实质性证明段，是本文上分的重要原因。

既然上文已经指出IL-6重要性，这里就拿IL-6 KO鼠来做，再拿外源性IL-6，也就是rIL-6做rescue；以及SC144，一个IL-6共受体GP130的抑制剂，来做减补法论证。

当然，会有同学说，害，你不是讲你是选的穷人文章吗，这敲除鼠都用上啦！其实吧，IL-6这种基因的KO鼠，并不需要自己敲的，直接买就行了，也不会贵的突破天际的。

直接把刚刚一直用的IR+PH模型放在IL-6 KO鼠背景下，检测用或不用MLT或rIL-6的效果。这里观察的是增殖水平的marker pH3的情况。

这个结果挺能说明问题的，因为仅补MLT或rIL-6效果均不明显，而都补上后则显示出明显增殖促进作用。当然，有一点我觉得值得改进：为什么不给出WT鼠在I/R+PH后予vehicle或MLT的数据？

下面是用抑制剂后增殖水平（分别以PCNA、pH3计），结果符合预期。

据此可以说，MLT的对增殖再生的促进效果是IL-6依赖的。当然，IL-6依赖并不代表着IL-6一定要亲自下场（因为单补充rIL-6似乎没有太大的效果）：它可能和MLT的其他机制一起有协同作用；也不代表着不存在非IL-6依赖的pathway。

Fig6

作者的机制已经证完了，下面就请出更真实模拟SFSS、但也因为死的太多不太容易得到稳定全过程数据的IR+exPH处理方法。

微循环对于这种缺血性/炎性疾病来说是一个永恒的重要问题。不论是I/R还是SFSS都有微循环的破坏，特别是对于SFSS来说，微循环紊乱是其重要病理生理学特征，而微循环的维持对于防治SFSS非常重要。

作者用了活体荧光显微镜来观察，这其实也不是非常尖端的技术，尤其是对于苏黎世大学这种单位...作者发现复灌3小时后微循环血流量明显减少，而MLT治疗组的微循环血流情况就明显好于对照，甚至直逼sham组的水平。

类似的，作者还检测了白细胞粘附在微循环血管的情况，共同论证MLT对微循环的保护作用。

下面是生存情况。作者还拿出了前面的那个SC144论证了IL-6对于疗效的意义。

等一下...你为什么要给两张生存图....难道不是上图E就够了吗？而且细细一看...emmm，为什么D E图的生存曲线基本重合呢（真是不愧鄙人玩了那么多年找不同）？这分明就是一组实验强行画出两张图好吧...搞不懂有什么必要...难道说是传说中的强迫症吗？

这张图也可以引申出这样一个假设：MLT的SFSS保护作用总体上是IL-6依赖的。当然，也肯定有其他的一些机制参与其中（例如文献指出高浓度MLT有抗氧化应激作用）。

Fig7

尝试更加真实的SFS-LT模型，并探讨IL-6的下游。

说到底肯定还是实际上做了肝移植的SFS-LT模型更真实。当然这个模型的问题也很显然，那就是死的太多，以及确实不好操作。

对于肝移植，我们得特别注意他的用药方式。肝移植药物干预有三种途径：供体、灌注保存中、受体，而供体给药对于大部分死亡供体肝移植来说比较困难。当然了，活体肝移植供体给药也不是不可能就是了。本文中的给药是沿用前面的给药方式（术前、复灌后各给10mg/kg）的同时，灌注保存液中也加入一定量的MLT。

首先指出生存情况：

其次给出肝脏关键炎症相关分子IL-6 IL-10 TNFα以及肝细胞生长因子HGF在复灌后3h / 6h的mRNA表达，发现MLT治疗组都有增高。这和上文探讨的机制也是相符的。当然，IL-10的增高也提示MLT对SFSS的疗效可能还有其他机制的参与。

下面作者希望再往下走一点，指出IL-6的下游通路。不过可能是没钱或没时间或没兴趣了，他只做了表征，即测定了前人已经证实的gp130-STAT3通路两个marker的表达：

最后是给出IL-6通路抑制剂SC144可以取消MLT的疗效。（是的没错这图和上面的图B其实也是一组实验画与没画+SC144组而劈成的两张图...）

总结：

本文的发现是一个很有意思的发现，不仅是因为其揭示了褪黑素对SFSS这种比较特别的肝外科情景具有意想不到的潜在疗效，更因为其展现了褪黑素功能的多样性。褪黑素抗SFSS的机制是多方面的：SFSS的发生发展中，肝细胞损伤是重要因素，而MLT可保护肝细胞（可能是透过抗氧化应激作用）；在SFSS的发生发展中，微循环往往遭到破坏，而MLT可以舒张微循环（当然这也可能部分源于抗氧化作用带来的较好微环境）；在SFSS的发生发展中，肝细胞再生能力至关重要，而MLT可以促进肝细胞再生，这种促进再生的机制是间接的，可能一方面是由于保护了肝细胞及微环境给增殖再生创造了良好条件，另一方面则可能源于某种不知具体机制的免疫调制作用——促进单核细胞浸润、表达IL-6，进而通过IL-6依赖的通路促进肝细胞增殖。

文献指出，褪黑素在常规肝脏IRI模型下具有保护作用，但显示出对IL-6的抑制。这与本文看似矛盾的结果，其实也是本文能发好paper的重要原因。或许可以这样推 测：在常规肝脏IRI下，只有单纯的缺氧及有关应激反应，这时如果直接予以褪黑素，其发挥抗氧化作用而产生保护效果，因此后续的炎症反应（包括IL-6）都免了。

而在IR+PH的模型下，小肝带来的特殊应激，可能使得肝脏局部的环境呈现出与传统IRI不同的免疫微环境（最大的不同就是肝细胞增殖通路激活程度的巨大差异），在这种环境下，MLT的其他优势得以进一步发挥：在发挥直接保护作用并提供良好增殖微环境的同时，通过某些方法利用这种特殊的局部环境，引来更多的免疫细胞浸润并让他们表达更多的促增殖的IL-6，进而间接促进肝脏再生。这几招联合起来，最终战胜SFSS。

文中发现：MLT作用的IL-6依赖性、单纯补充IL-6对增殖促进作用效果明显差于IL-6+MLT合用；以及其他文献指出：单纯肝切除时MLT无促增殖效果、同属于抗氧化应激物质的S-腺苷甲硫氨酸在促炎的免疫微环境下也可促进IL-6的产生，都符合上述猜想。

因此，本文也从侧面深刻揭示了SFSS并不仅是普通的肝脏IRI模型予以魔改的结果，其成因、表现、内在机制、分子生物学层面上的病理生理学过程都与纯IRI有很大不同，而且总的来说，较单纯的IRI损伤更加复杂，因此也更需要深入的研讨，以及类似于褪黑素的这种可能发挥多管齐下作用的药物。

总的来说，本文在题材上的创新性并不强，本质上说虽然SFSS并不是普通的IRI，但这仍然是人家玩剩下的topic。不过仔细一看，结果上的确有一定的新颖之处，是挺值得引用的文章（所谓高分杂志就是被引的多的杂志，因此如果你的文章没有引用价值，不能解决问题又不能抛砖引玉推动讨论，那凭什么发高分？）此外，本文的工作量也非常大，这么多小鼠手术的难度不说，测的时点、样本也很多，估计是忙了挺久，正所谓创新不够，功夫来凑。但是，从花销上说，这样的一篇工作，我认为仍然是国内一般临床医生的课题组一个研究生的开销份额所能经受得起的，因此有学习的价值。

此外，褪黑素极高的安全性也极大地降低了其临床转化的成本。期待其今后在活体肝移植领域的临床试验中展现出理想的作用。（注：安全 指的是毒副作用极低，并不意味着褪黑素对人体的影响极低。研究表明，除了嗜睡等副作用外，过量服用或将对年轻人的生殖腺发育产生不良影响。下图是drugbank上的毒性介绍，请同学们服用类似药物的时候严格注意剂量。）

Declaration

本推文是2020年3月的文献阅读笔记。

由于这篇推文由爱好生物医学科研的本科生完成，必然有学术性的错漏等，希望各位读者海涵、斧正。欢迎诸位老师同学留言讨论，以期共同进步。来稿、交流、反馈等请直接后台留言。本文是OA文章，发表作品的版权属于出版社或（和）作者。任何药物相关信息皆是学术讨论，用药请遵医嘱。部分图片源自网络，如有侵权请联系我们删除。