直播题目：质谱流式技术在肿瘤免疫研究中的应用

主要内容：

一、质谱流式技术简介

二、质谱流式技术应用及分析流程

三、质谱流式技术在肿瘤免疫研究中的应用案例

导读

骨关节炎是全世界最常见一种退行性的关节疾病，其特点是逐渐的软骨破坏、软骨下重塑和滑膜炎症。尽管传统的药物治疗旨在防止软骨进一步流失和关节功能障碍，但目前还没有针对OA发病机制的理想策略。褪黑素通过与特定的受体和下游分子结合表现出多种调节特性，并通过细胞内靶点发挥无数与受体无关的作用，作为软骨细胞保护剂、抗炎调节剂和自由基清除剂。褪黑素还通过直接/间接调节主要昼夜CLOCK基因的表达来调节软骨的再生和退化。由于褪黑素对软骨平衡的影响，作者提出了褪黑素在预防和治疗OA中的潜在作用，即通过调节昼夜钟基因、减轻软骨细胞凋亡、抗炎活性和清除自由基。

论文ID

题目：The potential remedy of melatonin on osteoarthritis

译名：褪黑素对骨关节炎的潜在治疗作用

期刊：Journal Of Pineal Research

IF：13.001

发表时间：2021年8月26日

通讯作者单位：中山医科大学附属医院

DOI：https://doi.org/10.1111/jpi.12762

主要内容：

骨性关节炎

骨关节炎是最常见的关节疾病，是由于软骨细胞赖以生存的正常软骨环境的丧失造成的。这导致软骨细胞的数量减少，导致病理和生物力学的变化，如软骨层变薄，产生裂缝，软骨细胞的分布和排列发生变化。所谓的 "磨损性 "骨关节病，加上软骨损伤的无力修复，长期以来被认为是OA。然而，在21世纪，越来越多的证据表明，炎症在OA的过程中起着关键的作用。在OA的早期阶段，胶原纤维结构变性，蛋白多糖被大量降解，关节面逐渐溃烂。因此，软骨的机械性能受到影响，软骨随后变薄和丧失，导致放射学上不对称的关节间隙变窄。

软骨变性在OA中涉及到软骨的变性，其特点是表层区域以溃疡和纤维化的形式出现，随后裂缝延伸到软骨下骨和缺陷，导致软骨变薄，软骨下骨质烧毁。此外，软骨下的骨质逐渐暴露，烧蚀下面的骨质稀少，表现为骨质 "瘀伤 "和 "囊肿"，并在软骨下的位置形成新的骨质，以及边缘。

右膝OA示意图

分子机制

OA的发病机制涉及软骨细胞的增殖、集群的形成和ECM降解酶的产生，包括基质金属蛋白酶和具有血栓软骨素图案的分解酶和金属蛋白酶家族，它们分别负责COL2和aggrecan的降解。其中，MMP-13可裂解胶原蛋白、凝集素和纤连蛋白，对COL2的降解活性最强。同样，解聚蛋白样金属蛋白酶ADAMTS4和ADAMTS5负责OA的发展。在OA的进展阶段，软骨细胞通过增殖和ECM生产增加合成活动，并通过清除受损基质增加分解活动，以促进软骨基质和下层骨的重塑。软骨细胞表达多个Wnt家族成员，并激活典型的Wnt信号，以增加β-catenin的活性，并通过Frizzled受体鼓励基质的破坏。此外，在软骨被破坏的区域，机械负荷的增加会降低sclerostin，以调节骨形成，从而增加局部的骨重塑。然而，分解代谢活动的增加导致缺陷部位合成代谢平衡的失衡，导致修复失败，软骨进一步退化，软骨下的骨适应，以及随后的滑膜炎症。

滑膜炎症

在滑膜关节中，软骨的破坏促进了滑膜的增生和血管生成，导致继发性炎症和关节内的炎症环境，表现为软组织肿胀和关节积液。滑膜病理过程中促炎症细胞因子和ECM降解酶的过量产生直接作用于软骨细胞，扰乱软骨的平衡。此外，新的ECM的合成超过了ECM成分的降解，推进了新陈代谢和分解代谢之间的不平衡，导致更多的软骨损失。疾病的加重导致基质的失调，软骨的进一步侵蚀，炎症介质的表达增加，以及软骨的最终破坏 。

OA中慢性低度炎症的分子机制

在创伤和软骨退化的条件下，受刺激的滑膜细胞会分泌大量的炎症因子，包括促炎症细胞因子、趋化因子、MMPs和活性氧，对软骨的稳态环境产生高度破坏性的影响。总的来说，促炎症细胞因子，如白细胞介素-1β、IL-6和肿瘤坏死因子-α，是滑液中强大的分解代谢因子，通过上调分解代谢和炎症反应，下调合成代谢事件和肥大分化，激活疾病过程。失衡的合成代谢和分解代谢平衡加剧了关节软骨的主要成分COL2的分解。这通过抑制COL2的主要转录因子减少了合成代谢途径介质的表达，导致滑膜关节的破坏。

临床治疗

根据一般危险因素、局部危险因素、症状、体征和损伤，临床治疗是为了改变症状和结构。非药物管理策略，如病人教育、减轻体重、使用矫形器、运动和机械支撑等，被主张用于症状轻微的病人。一般来说，更多的保守疗法被启动，以缓解轻度到中度的症状，包括止痛药和抗炎药，并在早期阶段阻止OA的发展，使用口服葡萄糖胺和关节内注射HA。手术干预通常是保留给最严重的疾病。然而，这些改变症状和结构的方法无法预防或逆转OA的进程。

褪黑素

褪黑素是由Aaron B. Lerner及其同事在1958年首次分离出来的，是一种主要来自松果体的生物制剂，但也由无数的组织类型合成和分泌，如视网膜、皮肤、肝脏、肠道、卵巢、睾丸和骨髓。在昼夜节律的控制下，褪黑素发挥着各种生理功能，包括抗衰老、抗氧化、镇痛和催眠作用。在哺乳动物中，松果体褪黑素的合成由下丘脑上核负责计时，是一个复杂的酶促途径的一部分，其中色氨酸在5-羟色胺N-乙酰转移酶的控制下连续转化为褪黑素。一般来说，褪黑素在夜间产生，在白天被抑制。在健康人中，褪黑素在晚间早期分泌，在凌晨2-3点之间达到最大水平，约为60-200皮克/毫升，此后逐渐下降到0-20皮克/毫升。褪黑素的释放和持续时间取决于夜间长度；这种独特的特性使褪黑素的生理功能能够根据日常和季节的需要进行调整。有趣的是，在≥90岁的人中，褪黑素水平逐渐降低到低至年轻时水平的20%，而在青春期后，所有年龄段的女性通常都较高。

褪黑素及其代谢产物通过受体依赖作用成为有毒物种的强大清除剂，并通过抑制氧化压力成为广谱抗氧化剂。这调节了广泛的分子信号通路，包括在不同的病理生理情况下参与炎症、细胞凋亡、增殖和转移的分子信号通路。通过受体非依赖性作用，褪黑素诱导了一系列清除机制，包括与过渡金属结合，抑制羟基自由基的形成，刺激抗氧化酶的转录和活性。此外，褪黑素是几种外源性和内源性自由基的拮抗剂，其广泛的抗氧化功能对线粒体的特性具有至关重要的意义。那就是褪黑素能够直接清除以氧为中心的自由基和有毒的ROS，减少对关键细胞大分子的氧化损伤。褪黑素激活抗氧化酶，包括谷胱甘肽过氧化物酶和谷胱甘肽还原酶，并加速谷胱甘肽的合成，使其成为限制自由基损伤的关键内源性因素。因此，褪黑素能中和氮基毒物，还能抑制促氧化酶--NO合成酶。

褪黑素对软骨稳态的影响

中枢神经系统中的下丘脑SCN和外周组织中的时钟通过正负反馈回路协调调节组织特定的下游基因组和免疫系统的昼夜节律。昼夜节律的调节紊乱导致各种衰老和炎症相关疾病的发生，如OA。昼夜节律基因包括转录激活剂，转录抑制剂，以及核激素受体。昼夜节律功能随着年龄的增长而下降，表现为昼夜节律强度的下降和昼夜节律相位的改变，从而导致错位或内部不同步。功能性的昼夜钟驱动基因的下游表达，包括那些参与细胞凋亡、ECM重塑和氧化应激途径的基因，以昼夜方式调节软骨模板的软骨内化和生长板的软骨细胞增殖。

与褪黑素的分泌一样，软骨细胞的增殖也遵循昼夜规律，褪黑素对骨和关节有强大的局部影响。这通过调节软骨的生长和成熟来影响软骨的平衡，通过MT1和MT2介导的软骨类型之间有不同的影响。同时，褪黑素在骨髓中合成，以响应循环的外源性褪黑素，并以两倍于夜间血液水平的浓度累积。褪黑素在大鼠和鸡软骨细胞中产生，通过MT1和MT2受体调节软骨的生长和成熟，内源性和外源性褪黑素的作用协同调整软骨细胞中枢SCN时钟的节律性表达。

OA软骨细胞中褪黑素信号通路的综合观点

褪黑素调节OA的主要昼夜节律基因

转录激活因子BMAL1直接调节许多涉及软骨平衡的分解代谢、合成代谢和凋亡基因的昼夜表达；然而，软骨细胞基因Bmal1的表达在人类OA和老年小鼠软骨中是失调的，小鼠软骨细胞中靶向Bmal1的消融消除了其昼夜节律，导致更多的软骨退化。BMAL1的过量表达可以挽救由IL-1β引起的表达变化，这与Rev-Erbα抑制的效果一致。相反，转染沉默信息调节器1型的小干扰RNA可降低BMAL1的蛋白表达，并适度增加PER2和Rev-Erbα的表达，这表明Bmal1的关键基因通过与SIRT1的串扰参与SIRT1介导的软骨稳态。在人类软骨细胞中，褪黑素降低过氧化氢诱导的SIRT1 mRNA和蛋白表达，SIRT1的下调与促炎症细胞因子的产生、炎症介质的表达以及软骨破坏分子的减少相关。此外，10 nM褪黑素对H2O2刺激的软骨细胞的影响被SIRT1的抑制剂sirtinol和SIRT1 siRNA所逆转。因此，到目前为止，SIRT1刺激是发挥软骨基质再生潜力的细胞保护和抗炎作用的核心，这些作用由BMAL1和褪黑素调节。在胶原酶诱导的OA大鼠模型中，褪黑素单独或与运动结合可增加和恢复BMAL1的表达和体内。因此，无论是否有运动，褪黑素诱导的BMAL1水平下降与OA的发病机制有关。

褪黑素对OA多方面功能的总结

在小鼠软骨细胞中加入褪黑素可以促进细胞生长，加速其节律性基因Col2a1、Acan和Sox9 mRNA的表达，但抑制Col10a1的表达。外源性褪黑素还能改变昼夜节律基因Bmal1、Mt1和Mt2的表达，并诱导褪黑素合成酶芳基胺N-乙酰转移酶的循环mRNA表达，表明外源性褪黑素能调节Bmal1和其他节律基因的昼夜表达。此外，在人类OA的体外模型中，PER2的表达峰值升高，但BMAL1的表达峰值降低，这表明骨关节炎软骨细胞中内在的昼夜节律基因Bmal1和Per2的表达发生了改变。敲除Per2可减弱蛋白多糖酶的表达，这些酶对软骨的破坏很重要，而CLOCK、CRY1/2或PER1在受损和未受损的软骨细胞中没有影响，表明PER2的表达增加与OA的发展有关。由于昼夜节律基因Bmal1和Per2似乎驱动了参与OA的基因的下游表达，因此需要进一步的研究来阐明褪黑素在OA的起始和发展过程中对节律基因的控制作用。

褪黑素减轻OA的炎症反应

软骨细胞产生促炎症因子，包括IL-1β、IL-6和TNF-α，以及ECM降解酶，如MMP-13和ADAMTS5，导致OA过程中软骨细胞和滑膜细胞代谢功能紊乱的恶性循环。MMP-3的表达依赖于TNF-α和IL-1β，并在受炎症性椎间盘疾病影响的髓核细胞中有所变化。通过刺激NF-κB途径，IL-1β抑制人类间充质干细胞的软骨生成，并抑制软骨特异性ECM的合成。

由昼夜节律调节的激素，如褪黑素，通过调节促炎症因子、炎症介质和ECM降解酶，对OA的发病机制有明显的影响。褪黑素的抗炎活性涉及多种途径和分子的激活，直接或间接抑制NF-κB信号，终止炎症反应。即使在IL-1β存在的情况下，褪黑素也能在mRNA和蛋白水平上促进软骨基质的表达，并通过激活MMP-13来调节OA软骨的基质重塑。在临床前和临床OA环境中，褪黑素的细胞保护和治疗潜力已被证实，与此相反，褪黑素对类风湿关节炎的预后有争议的影响。

在人类、小鼠和老年小鼠膝关节OA中，SIRT1在软骨中的表达减少。软骨细胞中SIRT1的抑制会增强对IL-1β、TNF-α和地塞米松的促代谢反应。成年杂合子SIRT1敲鼠和SIRT1点突变小鼠的OA进展增强，，软骨特异性SIRT1敲除小鼠的OA进展增强。激活SIRT1表现出软骨保护的潜力；因此，这种新的途径对研究人员解决OA有吸引力。在氧化应激刺激的人软骨细胞、大鼠和兔子OA模型中，褪黑素通过SIRT1途径发挥保护性抗炎作用，抑制IL-1β引起的MMP-3和-13的产生，抑制NAMPT和活化T细胞核因子途径。这表明褪黑素对OA软骨有保护作用。

在体外人软骨细胞OA模型中，褪黑素可减少IL-1诱导的aggrecan、COL2、ADAMTS4和5以及MMP-9和13，以防止创伤性OA的发生。在人滑膜细胞中加入0.01μM褪黑素，通过ERK/p21CIP1/p27KIP1途径抑制增殖，并增加酸感应离子通道3 mRNA和IL-6的蛋白表达。在浓度≥0.2mM时，褪黑素通过PI3K/AKT和ERK途径抑制人类滑膜成纤维细胞中IL-1β和TNF-α的产生，涉及NF-κB、miR-3150a-3p和MT1。同样，≥10mg/kg的褪黑素可逆转小鼠模型中胶原蛋白诱导的关节炎。此外，100μM的褪黑素可减轻D-半乳糖诱导的人类滑膜细胞衰老，并通过SIRT1信号传导抑制p21、p16和p-p65蛋白的表达。这表明褪黑素-SIRT1信号传导对滑膜细胞发挥保护作用，增加HA的合成，防止细胞衰老。

在胶原酶诱导的OA模型中，20mg/kg/d的褪黑素与跑步机运动相结合，通过增加IL-6和TNF-α、内皮Per-Arnt-Sim域蛋白1、Runt相关转录因子和MMP-13，对软骨产生协同和保护作用。这些影响在OA的初始阶段是最值得的。褪黑素在早期阶段阻止TNF-α激活的ECM损失，在晚期阶段通过caspase3介导的细胞凋亡促进矿化并诱导ECM重塑。通过内部激活TGF-β1信号，褪黑素通过抑制促炎症细胞因子和ROS的产生，逆转了软骨的退化。这导致了软骨标记基因的激活，包括Col2a1、Acan和Sox9，并抑制了肥大标记，即胶原蛋白X。

褪黑素的不同特性来自不同的机制，取决于不同的浓度和细胞系。虽然褪黑素增强了炎症的早期阶段，但它也有助于抑制炎症，以防止与慢性炎症相关的并发症。在RA中，褪黑素发挥了炎症作用，在一些研究中显示促进了疾病的进展，而其他研究显示褪黑素发挥了抗炎作用。然而，褪黑素在OA和其他关节炎的抗炎作用已被证实。此外，低浓度的褪黑素可以抑制细胞死亡，并通过抑制OA膝关节中活跃的MMP-13、促炎症细胞因子、ADAMTS和催化转录因子，恢复软骨的主要成分COL2。然而，高浓度的褪黑素不能恢复暴露于TNF-α后的COL2A1表达，这表明褪黑素是TNF-α对软骨细胞的细胞毒性作用的原因。

褪黑素清除OA中的自由基

SIRT1增强软骨特异性基因的表达，通过ROS依赖的p38激酶激活保护软骨细胞免受辐射引起的衰老，并抑制软骨中软骨细胞的凋亡；因此，活跃的SIRT1是正常软骨稳态所必需的。在渗透压下，SIRT1诱导NFAT5的表达，这是一种补体反应性增强剂结合蛋白。这可以保护细胞在高渗压力下免受损伤，并诱导参与基质平衡的基因转录，以自动调节健康软骨的细胞外渗透环境。然而，NFAT5作用于一组特定的目标，包括TNF-α、IL-6、NO合成酶2和MMP-13，但抑制OA软骨中渗透适应目标的活性。除了高渗性，促炎症因子，如TNF-α和IL-1β，激活了OA患者成纤维细胞样滑膜细胞中NFAT5的表达和核定位。

氧化应激和炎症协同作用，决定了衰老和创伤相关OA的发生和发展。缺氧下的缺血诱导间充质干细胞的凋亡，增强受伤或患病关节的炎症微环境中的氧化应激。这停止了间充质干细胞的软骨分化，导致新软骨的破坏。ROS和RNS的生产升高，通过OA中的DNA损伤诱导过早软骨细胞的衰老，这些自由基被认为是OA的主要致病因素。在D-半乳糖诱导的老化兔模型中，D-半乳糖诱导滑膜细胞的衰老，以增加ROS的产生和减少HA的产生，而HA是软骨基质和滑液的重要组成部分。使用广泛的抗炎和抗氧化药物，如褪黑素，可能代表一种有效、安全和有希望的干预，以延迟OA的发生和进展。

褪黑素通过抑制氧化应激，减少促炎症细胞因子的表达，缓解线粒体功能障碍，对OA起到保护作用。褪黑素通过抑制ROS的积累和增强超氧化物歧化酶的表达来抑制MMPs的激活，从而防止ECM的过度降解。在1μM的浓度下，褪黑素通过抑制MMPs和保持超氧化物歧化酶的活性，明显恢复了IL-1β、IL-6和TNF-α对MSC软骨生成的抑制活性，这可能与褪黑素清除自由基的能力有关。在100μM褪黑素的存在下，小鼠骨髓间充质干细胞可以通过抑制ROS的积累和p53/ERK/p38途径的激活来保护其免受铁过载引起的异常分化和衰老。

结论

作者讨论了褪黑素在衰老和创伤相关OA中的分子机制、发展战略和未来方向。然而，未来的研究必须阐明褪黑素在OA不同阶段的作用机制，特别是在OA早期的治疗效果。当代OA的治疗方法主要集中在疾病早期的症状控制，以及疾病晚期的缓解治疗。然而，OA的恶性循环需要被阻断，以防止晚期疾病的发展，而这是很难被逆转或改变的。

原文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/jpi.12762

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