玛咖（Maca）是十字花科独行菜属植物玛卡特独行菜LepidiummeyeniiWalp.的根茎，原产于南美洲秘鲁的安第斯山脉。根据颜色不同，分为黑、白、黄、红等13个类型。研究发现，黑玛咖粉营养成分优于黄玛咖粉，且玛咖提取物中的营养成分亦优于玛咖原粉[1]。多年来研究表明，玛咖具有增强体力、增强雄性性功能、调节女性内分泌、抗骨质疏松及抗肿瘤等多种功效[2-6]。但不同提取方法对玛咖抗疲劳作用的影响尚未见文献报道。

目前，中药谱效关系学已广泛用于中药的药效物质基础研究[7-9]，但黑玛咖抗疲劳作用的物质基础研究相对较少。本研究通过小鼠力竭游泳实验、检测肝糖原和血清乳酸水平，比较黑玛咖8种提取物的抗疲劳作用；采用超高效液相色谱-飞行时间质谱（UPLC-Q- TOF/MS）法建立黑玛咖不同提取物的指纹图谱，并用偏最小二乘回归法（PLSR）分析阐述指纹图谱特征峰与抗疲劳作用的关联度，最终确定其主要药效成分，为深入研究黑玛咖的抗疲劳作用及科学阐明其抗疲劳作用的药效物质基础提供依据。

1材料

1.1药品与试剂

玛咖采集于秘鲁，经天津药物研究院有限公司张铁军研究员鉴定为玛卡特独行菜LepidiummeyeniiWalp.的根茎，为黑玛咖。肝糖原试剂盒、乳酸试剂盒均购于南京建成生物科技有限公司。

1.2动物

SPF级雄性ICR小鼠270只，12周龄，体质量（21±2）g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，动物合格证号SCXK（京）2014-0004。

1.3仪器

Waters Acquity IClass UPLC超高效液相色谱-质谱联用仪（美国Waters公司）；Waters Xevo G2 QTOF质谱仪（美国Waters公司）；色谱柱为Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；FA2004N电子分析天平（万分之一，上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；3K15型离心机（德国Sigma公司）；723型可见分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司）；电热恒温水浴锅（天津市华北实验仪器有限公司）。

2方法

2.1黑玛咖提取物的制备

2.1.1黑玛咖20%、40%、60%、80%、95%乙醇提取物（醇提物）及水提取物（水提物）的制备分别称取玛咖饮片500 g至10 L圆底烧瓶中，分别依次加入10倍量（5 L）20%、40%、60%、80%、95%乙醇和水，回流提取2 h，热滤，回收溶剂（50～60℃）至一定体积，水浴继续浓缩（70～80℃）至稠膏，收率分别为每克浸膏相当于生药2.06、1.83、1.79、2.33、3.07、1.01 g，备用。

2.1.2黑玛咖水提物加挥发油样品及水蒸气蒸馏法药渣的醇提物的制备称取黑玛咖饮片500 g至10 L圆底烧瓶中，加入10倍量水（5 L），水蒸气蒸馏法提取，提油5 h，热滤，收取挥发油及水液，回收水（50～60℃）至一定体积，水浴继续浓缩（70～80℃）至稠膏，将挥发油均匀加入稠膏中，即得黑玛咖水提物加挥发油样品，收率为每克浸膏相当于生药1.61 g，备用。取水蒸气蒸馏法提取后的药渣，用5倍量白酒（45度古井贡酒岁月经典5年陈酿）提取2 h，回收乙醇（50～60℃）至无醇味，水浴继续浓缩（70～80℃）至稠膏，即得水蒸气蒸馏法药渣的醇提物，收率为每克浸膏相当于生药6.92 g，备用。

2.2黑玛咖不同提取物的抗疲劳作用

2.2.1实验分组及给药将270只雄性ICR小鼠随机分成3批，每批90只。各批小鼠适应性喂养1周后，均随机分为以下9组：对照组、黑玛咖水提取物组（水提物）、黑玛咖20%乙醇提取物组（20%醇提物）、黑玛咖40%乙醇提取物组（40%醇提物）、黑玛咖60%乙醇提取物组（60%醇提物）、黑玛咖80%乙醇提取物组（80%醇提物）、黑玛咖95%乙醇提取物组（95%醇提物）、黑玛咖水提物加挥发油样品组（水提物加挥发油）、黑玛咖水蒸气蒸馏法药渣的醇提取物组（药渣醇提物），每组10只。将黑玛咖各提取物均按生药剂量2.5 g/kg，以蒸馏水配成所需浓度，按10mL/kg ig给药，对照组ig给予等量蒸馏水，每天1次，连续14 d。

2.2.2力竭游泳实验[10]末次给药30 min后，于小鼠尾根部负重体质量8%的铅皮，每只单独放入水深50 cm、水温（25±1）℃的塑料圆柱体中，记录负重小鼠自开始游泳至头部沉入水中，10 s仍不能返回水面的时间，即小鼠力竭游泳时间。

2.2.3肝糖原测定[10]末次给药30 min后，将小鼠置于（30±1）℃水中不负重游泳90 min，颈椎脱臼处死，取肝脏，生理盐水漂洗，称取肝脏并参照糖原检测试剂盒说明书检测肝糖原水平。

2.2.4血清乳酸测定[10]末次给药30 min后，将小鼠置于（30±1）℃水中负重游泳（体质量6%）10 min，分别于游泳后即刻、游泳后休息30 min自眼眶静脉丛取血。4℃，3 000 r/min离心15 min，取血清，−20℃保存。参照乳酸检测试剂盒说明书检测血清中乳酸水平。

2.3黑玛咖不同提取物的UPLC-Q-TOF/MS分析[11-14]

2.3.1色谱条件采用色谱柱WatersACQUITY UPLC HSS T3 C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；体积流量0.3 mL/min；进样量为3 μL；柱温为35℃；进样时间为35 min；流动相为0.1%甲酸水溶液（A）-0.1%甲酸的乙腈（B）溶液。梯度洗脱程序见表1。

2.3.2质谱条件应用四极杆飞行时间串联质谱仪进行分析与鉴定。采用正、负离子模式，电喷雾离子源ESI；脱溶剂气体积流量700 L/h；脱溶剂气温度450℃；锥孔气体积流量50 L/h；离子源温度120℃；毛细管电压3000 V。相对分子质量扫描范围m/z50～1 500，数据采集采用MSE模式。

2.3.3样品溶液的处理  分别称取适量的黑玛咖8种提取物浸膏，采用50%乙醇配制成质量浓度为生药1 g/L的供试品溶液，过0.22 μm有机滤膜，备用。

2.4统计学分析

数据以表示，多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），方差齐时，多组间比较采用LSD法；方差不齐时，采用Tamhane’sT3法。所有统计分析均使用SPSS17.0软件进行处理。

3结果

3.1黑玛咖不同提取物抗疲劳作用比较

3.1.1对小鼠力竭游泳时间的影响与对照组比较，黑玛咖40%醇提物组、20%醇提物组、水提物组、水提物加挥发油组、药渣醇提物组小鼠力竭游泳时间均有延长趋势，但无统计学差异；与对照组比较，黑玛咖95%醇提物组、80%醇提物组、60%醇提物组小鼠力竭游泳时间均显著延长（P＜0.05），其中以黑玛咖95%醇提物的作用最为明显，结果见图1。

3.1.2对小鼠肝糖原水平的影响与对照组比较，黑玛咖80%醇提物能显著抑制因过度运动所致的肝糖原水平降低（P＜0.05），而60%醇提物虽有增加游泳后肝糖原水平的趋势，但差异无显著性，结果见图2。说明黑玛咖80%醇提物能够减少运动所致肝糖原的消耗。

3.1.3对小鼠血清乳酸水平的影响图3结果显示，游泳后休息30 min时，黑玛咖95%醇提物组与对照组相比小鼠血清乳酸水平显著降低（P＜0.05）；而黑玛咖20%、40%、80%醇提物组、水提物组、

水提物加挥发油组和药渣醇提物组小鼠血清乳酸水平均有降低的趋势，但与对照组相比无统计学意义。说明黑玛咖95%醇提物能够显著降低小鼠游泳后血清乳酸水平，促进乳酸消除。

3.2黑玛咖不同提取物的UPLC-Q-TOF/MS分析

在上述色谱条件下检测，采用正、负离子模式分别采集黑玛咖不同提取物的质谱信息，比较在正、负离子扫描方式下黑玛咖不同提取物中各个化学特征峰的信号强度，表明黑玛咖不同提取物大多数成分在正离子模式下的信号强度大于在负离子模式下的信号强度，且各特征峰分离良好，因此确定扫描方式为正离子模式，总离子流图见图4。结合文献信息，对UPLC分离出的23个主要特征峰进行分析并标记（图5），明确了20个特征色谱峰所代表的化学成分（表2）。

3.3黑玛咖提取物UPLC图谱与抗疲劳作用的PLSR分析

通过指纹图谱筛选出23个特征峰，这些特征峰与药效之间的关系可看作一个多元线性回归分析问题。多元线性回归分析是研究在线性相关的条件下，多个自变量（如指纹图谱中的色谱峰）对因变量（如药效指标）的数量变化关系[15]。采用SIMCA-P 12.0软件对23个化合物的相对含量（X变量）与抗疲劳作用（Y变量）进行PLSR分析。

黑玛咖提取物UPLC指纹图谱中的15、17、10、5、8、13、20、12、2号峰与抗疲劳作用呈正相关性，即相对含量增加，抗疲劳作用增强；剩下的14个峰与抗疲劳作用呈负相关性，见图6-A。自变量在解释对因变量贡献程度的大小时可通过VIP的数值大小来决定，一般认为VIP＞1时，对模型有显著贡献[16]。以力竭游泳时间为抗疲劳的药效指标时，通过SIMCA软件处理得到黑玛咖提取物中1、8、3、2、7、6、23、17和5号峰的VIP值均大于1，说明其对小鼠抗疲劳作用发挥重要作用，见图6-B。综合上述黑玛咖提取物与抗疲劳作用的PLSR分析结果，结合质谱数据与对照品信息比对，对8、2、17和5号峰进行指认，对应的化合物分别为N-苄基十六酰胺、N-苄基-5-氧代-6E,8E-十八碳二烯、1,3-二苄基-2-苯基-4,5-二甲基咪唑和N-十八烷酰胺。

4讨论

抗疲劳能力增强最客观和最直接的表现是运动耐力的提高，测定机体持续运动至力竭的时间可以反映机体的耐力。金指标负重游泳时间能直观地反映出小鼠运动耐力的大小，因此本实验采用负重游泳的方法衡量运动疲劳的程度[17-18]。ICR小鼠是国际公认的小鼠品种，繁殖力好，对疾病的抵抗力强，主要用于安全评价、药理学、毒理学、感染及免疫学等实验研究，已成为全世界最广泛使用的实验动物之一。在疲劳实验研究中，多以ICR雄性小鼠为研究对象，故本实验亦选用雄性ICR小鼠进行抗疲劳及谱效关系研究[19]。实验结果显示，黑玛咖95%、80%、60%醇提物均能显著延长小鼠力竭游泳时间，提高运动耐力，具有一定的抗疲劳作用。常用的体力疲劳的评价方法除了运动耐力实验外，还包括生化指标的检测。糖原是机体能源的贮存方式，机体剧烈运动会消耗大量糖原，因此糖原储备量可以反映运动耐力的强弱，继而反映机体疲劳程度[20]。本实验中，黑玛咖80%、60%醇提物能够减少运动时肝糖原的消耗，其中以80%醇提物更为明显。无氧条件下，肌肉中的糖原被分解产生大量乳酸，体内乳酸的量增加，会引起肌肉运动能力的下降，因此减少体内乳酸堆积，可以缓解机体的疲劳状态。本实验证实，黑玛咖95%醇提物能够降低小鼠负重游泳30min后血清乳酸水平，促进乳酸的消除[21]。通过比较不同提取方法得到的黑玛咖提取物在抗疲劳方面的功效，认为黑玛咖95%、80%醇提物表现出显著的抗疲劳作用。

中药药效物质基础是阐明中药作用的关键，是中药质量评价的基础与核心，谱效关系是建立在中药材指纹图谱的研究基础上，建立其化学成分与药效之间的关联性[22]。PLSR分析方法集多元线性回归分析、典型相关分析和主成分分析的基本功能于一体，在一个算法下，同时实现回归建模（多元线性回归分析）、数据结构简化（主成分分析）及两组变量间的相关分析（典型相关分析），能够最大限度利用数据信息，具有预测精度较高及模型易于解释等特点[23-24]。本研究采用PLSR分析黑玛咖不同提取物色谱峰面积与抗疲劳作用之间的关系，确定了指纹图谱特征峰所代表的4个化学成分，即N-苄基十六酰胺、N-苄基-5-氧代-6E,8E-十八碳二烯酰胺、1,3-二苄基-2-苯基-4,5-二甲基咪唑和N-十八烷酰胺与抗疲劳评价的金指标力竭游泳时间呈正相关性，且对模型有显著贡献，推测其为黑玛咖抗疲劳作用的潜在的药效物质。

玛咖酰胺和玛咖烯的主要化学成分被推测是玛咖抗疲劳的主要活性物质。据文献报道，这两类物质包含的化学成分能显著延长小鼠力竭游泳时间，降低长时间游泳后小鼠血乳酸、血乳酸脱氢酶的含量，增加游离脂肪酸水平及糖原储备量，显著提高抗氧化酶超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活力[25-26]。这与本实验发现黑玛咖提取物中的化合物N-苄基十六酰胺、N-十八烷酰胺、N-苄基-5-氧代-6E,8E-十八碳二烯与抗疲劳药效呈相关性的结果一致。下一步研究重点将对这4种药效成分进行定量分析及药效评价，为深入研究黑玛咖药效物质基础及建立全面可靠的质量控制方法提供思路。

参考文献（略）

来  源：刘  淼，黄莹莹，林梦雅，王春龙，李  欣，马宁宁，张艳军，宋丽丽，张密霞. 黑玛咖不同提取物的抗疲劳作用与谱效关系研究 [J]. 中草药, 2018, 49(9):2090-2096.