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褪黑素对花椒幼苗低温伤害的缓解效应

任利明1,谢 芳1,丁 飞2,张硕新1*

(1.西北农林科技大学 林学院,陕西 杨陵 712100;2.聊城大学 生命科学学院,山东 聊城 252000)

花椒(Zanthoxylum bungeanum)为芸香科花椒属植物,是药食两用的重要经济树种。我国的花椒属植物资源约有50个种或变种,常见品种有青花椒、红花椒、竹叶花椒和两面针等[1-2]。近几年,花椒在推动农业经济发展及生态文明建设方面发挥着重要作用,已被列入国家十三五规划经济树种之一。花椒的耐寒性较差,低温不但会影响其正常的生长发育,还会制约其地理分布[3-6]。因此,研究花椒对低温的响应机制具有重要意义。

低温胁迫分为寒害胁迫和冻害胁迫,寒害为0~12℃的温度胁迫,冻害为低于0℃的温度胁迫[7]。低温会对植物细胞膜造成严重伤害,这种破坏改变了膜结构和稳定性,引起膜脂过氧化,电解质外渗及植物体生理代谢紊乱。光合作用对低温非常敏感,低温通过破坏叶绿体和线粒体中的电子传递链而对光合作用产生不利影响,导致活性氧(ROS)的过量产生[8]。ROS过量积累会使参与卡尔文循环的关键酶SBPase失活,进而影响碳固定[9]。植物对低温的响应很复杂,一旦受到冷胁迫后,植物自身会形成结构上的适应、细胞内渗透调节物质的调节及抗氧化酶系统的清除作用等一系列防御机制[10-13]。植物体内生理变化物质受到复杂的基因网络调控。Adolf等[14]研究发现桑树在低温胁迫下多数基因参与调控植物激素信号转导、MAPK信号通路及次生代谢产物的合成,并筛选出与冷胁迫相关的候选基因。Tian等[15]研究得出花椒通过改变植物激素信号转导、物质代谢、光响应及细胞结构来响应和适应冷胁迫。

褪黑素(melatonin,简称MT)是一种广泛存在于动植物中的吲哚胺类化合物[16]。近几年,MT被认为是一种新的植物激素,在抵御各种生物及非生物胁迫中发挥重要作用[17-19]。MT可通过降低电解质渗透率和MDA含量来减轻石榴的膜脂过氧化[20],提高辣椒幼苗的抗氧化酶活性和脯氨酸含量,增强抗寒性[21]。同样,减轻光系统Ⅱ蛋白的下降及增强景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶(SBPase)活性来缓解光抑制[22-24],也是MT提高植物耐寒性的途径之一。此外,MT还可介导植物矿物质和抗氧化剂途径相关基因的表达来改善大豆幼苗的低温胁迫耐受性[25]。目前关于外源MT降低逆境胁迫对植物的伤害的研究报道较多,但将MT应用于缓解低温胁迫对花椒幼苗的伤害的研究尚未见报道。因此,本研究通过对花椒叶片喷施200μmol/L的MT(前期试验筛选),探讨MT在花椒低温响应中的作用,为提高花椒抗寒性和增强其生长适应性提供理论依据。

01

材料与方法

1.1 材料与处理

供试材料为韩城大红袍幼苗,苗龄为6个月,来源于陕西省韩城市三川秦种苗公司。移栽幼苗置于人工气候室培养,培养条件:温度为25℃,相对湿度为60%,光周期为12 h,光照强度为400 μmol·m-2·s-1。选择长势一致的幼苗,设4个处理,常温(CK)、常温+褪黑素(CKMT)、低温(CS)、低温+褪黑素(CSMT),每组30株幼苗,3次重复。褪黑素溶液(200μmol/L)喷施CKMT、CSMT组花椒叶片,CK、CS组叶片喷施去离子水,隔天喷施1次,处理5次。预处理后将CS、CSMT组放入人工气候室进行4℃低温处理,剩余2组正常条件培养。在处理的0、6、12、24、48 h以及13 d分别进行叶片取样,液氮速冻,-80℃低温保存。

1.2 测定方法

1.2.1叶绿素荧光参数用便携式荧光仪(Dual-PAM-100,Walz,Germany)在低温胁迫0、24、48 h、13 d测定完全展开叶,暗适应30 min后,打开测量光和光化学系统5 min内自动依据参数设定得到最大光化学效率(Fv/Fm)及电子传递速率(ETR)。

1.2.2生理指标测定采用硫代巴比妥酸法测定丙二醛(MDA)含量[26];超氧阴离子含量测定参考Zhang等[27];过氧化氢(H2O2)含量测定使用试剂盒(北京索莱宝科技有限公司),可见分光光度法;过氧化物酶(POD)活性测定采用愈创木酚法,参照陈建勋等[28]的试验方法;可溶性糖(SS)含量测定采用蒽酮比色法。1.2.3转录组测序取胁迫0、6、24 h的CS和CSMT组花椒叶片,各2个重复,装入锡箔纸内并标记(CS组编号:CS 0 h、CS 6 h、CS 24 h,CSMT组编号:CSMT 0 h、CSMT 6 h、CSMT 24 h)。RNA提取、质控、建库及测序均由北京诺禾致源公司完成。

使用DESeq2软件(1.20.0)筛选不同处理间的差异表达基因,筛选条件设置为padj≤0.05且Foldchange≥0。通过clusterProfiler(3.8.1)软件实现差异表达基因的基因本体(GO)富集分析,京都基因和基因组百科全书(KEGG)通路中差异表达基因的统计富集。背景基因集为所有进行差异显著分析的基因,padj<0.05作为显著性富集的阈值。

1.3 数据处理

所有试验均进行3次重复,采用SPSS 22.0软件进行方差分析,运用Duncan多重比较法检验(P<0.05)评估数据差异的统计显著性;使用SigmaPlot12.5软件创建图表。

02

结果与分析

2.1 低温胁迫下褪黑素对花椒叶绿素荧光参数的影响

在正常条件下,施用MT对Fv/Fm和ETR没有明显影响。低温处理下花椒幼苗的Fv/Fm、ETR均显著降低,并且随着胁迫时间的延长,下降幅度增加。CSMT处理的Fv/Fm、ETR均显著高于CS处理,胁迫24、48 h时,CSMT处理的Fv/Fm分别提高了14.18%、7.20%,ETR分别提高了36.28%、41.44%(图1)。说明低温处理抑制叶绿素荧光参数,MT对光合系统具有一定保护作用,可缓解低温伤害。

图1 褪黑素对低温胁迫下花椒叶绿素荧光参数的影响

Fig.1 Effect of melatonin on chlorophyll fluorescence parameters of Z.bungeanum seedlings under chilling stress

2.2 低温胁迫下褪黑素对花椒生理指标的影响

MDA作为膜脂过氧化的产物,其含量能够反映细胞膜损伤程度。CK与CKMT处理的MDA含量差异不显著,说明正常条件下喷施MT对花椒植株的MDA含量没有明显影响;胁迫处理48 h后,与CK相比,CS和CSMT处理的MDA含量显著增加,分别是CK的1.46、1.29倍;CSMT处理的MDA含量显著低于CS处理,表明低温逆境能显著提高MDA含量,MT处理对低温引起的氧化损伤有一定的缓解作用(图2)。

与CK相比,CS处理的H2O2含量在处理24、48 h时,分别为CK的1.39倍和1.38倍;CSMT的H2O2含量显著增加,分别为CK的1.29倍和1.20倍,与CS组相比,降低了6.67%、12.92%,说明低温显著增加H2O2含量,MT能够减轻低温伤害,降低叶片中H2O2的含量。

图2 褪黑素对低温胁迫下花椒丙二醛含量的影响

Fig.2 Effect of melatonin on MDA content of Z.bungeanum seedlings under chilling stress

CKMT与CK处理的POD活性无显著性差异,表明正常生长情况下MT处理对POD活性无明显影响;CS和CSMT处理的POD酶活性均显著高于CK,随着处理时间的延长,POD活性变化趋势为上升—下降—上升;胁迫48 h后,CSMT处理的POD活性较CK显著提高了53.36%,且显著高于CS处理,较CS增加了18.19%(图4)。

正常条件下MT对可溶性糖含量无明显影响,低温组叶片中可溶性糖含量显著高于常温组;低温处理下,喷施MT的花椒叶片可溶性糖含量较未经MT预处理显著升高了18.53%(图5)。说明低温胁迫会增加可溶性糖含量,MT可进一步促进可溶性糖的累积来缓解低温伤害。

2.3 转录组数据分析

2.3.1测序数据质量评估为研究MT响应花椒低温胁迫的转录组学变化特征,选取低温(CS)和低温+褪黑素(CSMT)处理0、6、24 h的花椒幼苗叶片进行测序,2个生物学重复,构建了12个高质量cDNA文库。测序共获得558,020,436条原始序列,549,392,182条高质量序列,Q20比率均在96.62%以上,Q30比率均在92.01%以上,GC含量分布在41.88%~44.39%(表1),符合碱基组成规律。以上结果表明,获得的基因文库测序数据质量符合要求,可用于后续生物信息学分析。

图3 褪黑素对低温胁迫下花椒活性氧含量的影响

Fig.3 Effect of melatonin on ROS content of Z.bungeanum seedlings under chilling stress

图4 褪黑素对低温胁迫下花椒叶片过氧化物酶活性的影响

Fig.4 Changes in POD activity as affected by melatonin in Z.bungeanum seedlings under chilling stress

图5 褪黑素对低温胁迫下花椒可溶性糖含量的影响

Fig.5 Effects of melatonin on the levels of soluble sugars in Z.bungeanum seedlings under chilling stress

表1 转录组测序数据质量汇总

Table 1 Transcriptome sequencing data quality summary

2.3.2差异表达基因筛选以padj<0.05为标准筛选差异基因,与CS相比较,CSMT在0、6、24 h分别有差异基因709(上调460,下调249)、1 630(上调678,下调952)、2 176(上调907,下调1 269)(图6)。CS和CSMT处理在0、6、24 h共同差异表达的基因有24个。CSMT在6、24 h分别特异性表达1 313、1 852个基因。随着胁迫程度的加深,花椒幼苗表现出更多的基因响应低温。

图6 差异表达基因火山图及韦恩图

Fig.6 The volcano plot and Venn diagram of the differentially expressed genes

2.3.3差异表达基因的GO富集分析GO富集分析是将DEGs映射到Gene Ontology数据库的各个term中进行GO注释。GO term分为生物学过程(biological process)、细胞组分(cellular component)和分子功能(molecular function)3大类。由于有些gene注释到多个GO term中,所以GO term总数大于DEG总数。CSMT6 h vs CS6 h和CSMT24 h vs CS24 h比对组中分别有1 630个和2 176个DEG注释到937个和894个GO term,在每个GO分类中挑选padj较小的前10个GO term条目进行展示(图7)。

在CSMT6 h vs CS6 h中,差异基因主要富集到生物学过程中应激反应(response to stress)、光合作用(photosynthesis),分别有42、31个;细胞组分中膜蛋白复合物(membrane protein complex)、类囊体(thylakoid membrane),分别有45、30个;分子功能中酶抑制剂活性(enzyme inhibitor activity)、丝氨酸型肽链内切酶抑制剂活性(serine-typeendopeptidase inhibitor activity),分别有23、17个。在CSMT24 h vs CS24 h中,差异基因主要富集到生物学过程中细胞型氨基酸代谢(cellular aminoacid metabolic process)、生物质量调节(regulationof biological quality),分别有26、26个;细胞组分中膜蛋白复合物(membrane protein complex)、光系统(photosystem),分别有35、21个;分子功能中四吡咯结合(tetrapyrrole binding)、铁离子结合(iron ion binding),分别有45、44个。

2.3.4差异表达基因的KEGG富集分析KEGG是系统地分析基因功能、基因组信息的数据库。通过pathway显著性富集分析能确定差异基因参与的最主要的生化代谢途径,散点图展示了富集最显著的20条pathway(图8)。

在CSMT6 h vs CS6 h中,差异基因富集于107条通路,显著富集的通路有2条,分别是光合作用(photosynthesis)、半乳糖新陈代谢(galactose metabolism),分别有21、15个;在CSMT24 h vs CS24h中,差异基因富集于114条通路,显著富集的通路有3条,分别是光合作用(photosynthesis)、光合天线蛋白(photosynthesis-antenna proteins)和淀粉和蔗糖新陈代谢(starch and sucrose metabolism),分别有22、13、38个。

图7 差异表达基因GO 富集

Fig.7 GO enrichment of the differentially expressed genes

图8 差异表达基因KEGG富集

Fig.8 KEGG enrichment of the differentially expressed genes

2.3.5光合作用相关差异基因光合作用是植物中最重要的代谢过程,低温显著影响光合作用。以CS6 h为对照,CSMT6 h显著富集到光合作用(photosynthesis)途径,共有21个差异表达基因,均上调。上调基因分别参与编码光系统Ⅱ的放氧增强蛋白PsbQ、PsbW、10 ku蛋白(PsbR)、Psb27和Psb28,参与光合电子传递的petF、petE、petJ和细胞色素b6f蛋白复合体,光系统Ⅰ的PsaD、PsaE、PsaK和PsaL(图9)。

以CS24 h为对照,CSMT24 h显著富集到光合作用(photosynthesis)途径,其中有7个基因上调表达,15个基因下调表达,主要涉及光系统Ⅱ、光系统Ⅰ、光合电子传递和细胞色素b6f蛋白复合体。差异表达较高的基因均与光系统Ⅱ相关(表2),表明褪黑素显著影响光系统Ⅱ。上调基因分别是参与编码光系统Ⅱ的放氧增强蛋白PsbO、22 ku蛋白(PsbS)、10 ku蛋白(PsbR)和Psb28,下调基因分别是参与编码光合电子传递的petF和细胞色素b6f蛋白复合体(PetD、PetB),光系统I的PsaN、PsaE和PsaO以及光系统Ⅱ的PsbA、PsbQ和10 ku蛋白(PsbR)。

图9 光合作用通路

Fig.9 The pathway of photosynthesis

表2 光合通路中高差异表达基因信息

Table 2 High differentially expressed gene information of photosynthesis pathway

2.3.6淀粉和蔗糖新陈代谢相关差异基因以CS24h为对照,CSMT24h显著富集到淀粉和蔗糖新陈代谢(starch and sucrose metabolism)途径,上调表达基因数目为32,下调基因数目为6。如图10所示,其中,与蔗糖合成相关的蔗糖合成酶(2.4.1.13)基因表达同时上下调;与淀粉合成相关的1,4-α-葡聚糖分支酶(2.4.1.18)、淀粉合成酶(2.4.1.21)、颗粒结合淀粉合成酶(2.4.1.242)基因表达均上调,与淀粉水解相关的α-淀粉酶(3.2.1.1)、β-葡萄糖苷酶(3.2.1.21)以及糖原磷酸化酶(2.4.1.1)基因表达上调,但β-淀粉酶(3.2.1.2)、海藻糖磷酸酶(3.1.3.12)基因表现为下调。

03

结论与讨论

3.1 结论

低温胁迫对花椒幼苗的光合能力及生理指标产生不良影响,而喷施200μmol/L的MT可有效提高低温胁迫下花椒幼苗的叶绿素荧光参数、POD活性以及可溶性糖含量,减少ROS及MDA的积累,缓解低温胁迫伤害。MT对低温胁迫下花椒幼苗的光合和物质代谢具有较大影响,通过诱导光合作用相关基因表达保护光合系统,调控与淀粉合成与分解相关的酶基因来改变渗透调节物质含量,达到提高花椒抗寒性的目的。

图10 淀粉和蔗糖新陈代谢通路

Fig.10 The pathway of starch and sucrose metabolism

3.2 讨论

低温胁迫会诱导ROS产生,过量的ROS会与质膜发生反应生成MDA,对植物造成氧化损伤。本研究中,低温胁迫下花椒叶片的活性氧、MDA含量均增加,而MT处理后两者的水平均低于单独低温处理。这表明MT可缓解低温引起的氧化损害,维持膜系统稳定性,Wang等[23]研究MT介导番茄抗寒性中也有类似的结果。ROS的清除与抗氧化酶活性密切相关,POD是植物体内普遍存在的、活性较高的一种抗氧化酶,可以将逆境产生的过量H2O2分解为H2O,减轻细胞膜损害[29]。本研究发现,随着胁迫时间的延长,花椒叶片中的POD活性呈上升趋势,MT处理可以进一步提高其活性,增强抗氧化能力。与Korkmaz等[21]对低温胁迫下辣椒幼苗的研究结果相似。渗透调节是植物适应逆境的主要生理机制,通过提高细胞液浓度,维持细胞内外水势差,提高细胞保水能力,从而适应胁迫环境[29]。本研究表明,低温胁迫下,经MT处理的花椒叶片较未经MT处理的叶片积累了更多的可溶性糖,这有利于植株应对低温伤害。

光合作用对低温十分敏感,叶绿素荧光参数能反映植物光合系统的受损程度。光系统Ⅱ反应中心是光合系统的重要组成部分,在光合作用的光能转化过程中起重要作用[30]。本试验中,MT处理提高了花椒低温胁迫下的Fv/Fm、ETR,表明MT缓解了低温对光合系统的损害程度,这可能与MT作为强抗氧化剂有关,相似的结果在番茄中也得到验证[31]。

转录组学是研究细胞内基因转录情况和转录调节规律的一门学科,有助于深入地了解转录水平对植物的环境胁迫应答[32]。本试验表明,与CS相比较,CSMT组基因表达数目在6 h和24 h分别有1 630、2 176个,可能是胁迫时间的增加使得幼苗产生更多的基因来抵御低温胁迫伤害。结合GO和KEGG分析结果,MT处理主要参与调控花椒的光合及糖代谢相关基因的转录表达。对光合作用途径的差异基因分析,可得出MT预处理减轻了低温对光合器官的损伤,特别是对光系统Ⅱ的保护。MT在胁迫早期上调了8个编码光系统Ⅱ的差异基因,分别为放氧增强蛋白PsbQ、PsbW、10 ku蛋白(Ps bR)、Psb27和Psb28,胁迫晚期上调了编码光系统Ⅱ的PsbO、22 ku蛋白(PsbS)、10 ku蛋白(PsbR)和Psb28差异基因。这些基因所编码的蛋白均属于光系统Ⅱ复合体,在光合作用中起到稳定细胞结构、色素结合、保证放氧复合物的稳定、各结构进行光保护等作用[33],表明MT处理通过调控光合作用相关基因的表达来减轻低温对光系统的伤害。

低温胁迫下,花椒叶片中的淀粉和蔗糖新陈代谢途径发生明显变化。MT上调了与淀粉水解相关的α-淀粉酶、β-葡萄糖苷酶以及糖原磷酸化酶基因,有利于花椒叶片中糖的累积。同时,MT上调了与淀粉合成相关的1,4-α-葡聚糖分支酶、淀粉合成酶、颗粒结合淀粉合成酶、果糖激酶基因。说明MT处理可通过调控有机物合成及分解相关的基因表达,从而改变渗透调节物质含量来提高花椒抵抗低温的能力。

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