由于生活节奏快、工作压力大、作息不规律等多种因素，越来越多的人极易出现肠道健康问题， 继而可能增加罹患多种疾病的风险。肠道菌群是与宿主共存、丰度可达百万亿的复杂而多样的微生物群落，菌群种类、菌群代谢产物、菌群多样性差异都与宿主的肠道健康直接相关。研究表明，膳食对肠道健康及菌群代谢具有重要的调节作用，而作为膳食重要组成部分的谷物对于肠道健康的影响已成为研究重点。

本研究基于非靶向代谢组学研究挖掘糙米经过发酵处理后对肠道健康有益的潜在功能物质；通过 硫酸铝建立便秘斑马鱼模型，通过其肠道荧光强度、肠道一氧化氮（nitric oxide，NO）清除率、一氧化氮合成酶（nitric oxide synthetase，NOS）mRNA 表达水平探究糙米酵素改善肠道运动的机制机理； 进一步采用体外模拟结肠厌氧发酵体系，评价糙米酵素对人体肠道微生物组成、结构特征和代谢产物 短链脂肪酸的影响，有助于深入理解植物生物发酵与肠道健康的关系，为开发相关健康产品提供理论依据。

实验方法

糙米用水充分浸泡后蒸熟至米粒膨胀、外硬内软、无生芯，加入干糙米 0.2%（质量分数）的根 霉粉 28 ℃发酵 36 h。将得到的糙米发酵液 100 ℃蒸煮 20 min 灭菌。将熟糙米和灭菌后的糙米发酵液 冷冻干燥得到糙米冻干粉和糙米酵素冻干粉。

将受精后 5 d（5 dpf）斑马鱼随机分配至 6 孔板中，每孔 30 尾，以硫酸铝（1 μg/mL）处理 6 h 建立便秘模型，共分为 2 组，处理组为适量糙米酵素冻干粉，阳性对照组为 50 µg/mL 多潘立酮，均 于 28 ℃干预 24 h。以有无心跳统计各试验组的斑马鱼死亡数量，测定便秘斑马鱼模型对糙米酵素的 最大耐受剂量（maximum talerated concentration，MTC）。

提取斑马鱼总 RNA，取 2.00 μg 反转录 20.0 μL cDNA，通过 q-PCR 检测 β-actin、nos1、nos2a 和 nos2b 基因的表达。以 β-actin 作为基因表达的内参，计算 nos1、nos2a 和 nos2b 基因的相对表达量。 引物序列详见表 1。

为了探索糙米发酵后影响肠道健康的关键功能代谢物，本研究通过非靶向代谢组学的方法对糙米 及糙米酵素中的小分子差异代谢物进行高通量测定。采用主成分分析（principal component analysis, PCA）和偏最小二乘法判别分析（partial least squares discriminant analysis, PLS-DA）的方法来显示糙 米经过发酵处理后的代谢差异（图 1-A 和图 1-B），结果均显示糙米酵素组与糙米组显著分离，表明 糙米经发酵后，其内源性代谢物变化显著。

图 1-C 采用火山图的形式展示发酵前后糙米中的显著差异代谢物（差异贡献值变量重要性投影 （variable important in projection，VIP）＞1，P＜0.05）。图 1-E 和图 1-F 的结果显示，与未糙米酵素 相比，糙米酵素共有 506 个差异代谢物（图 1-C），415 个上调、91 个下调（图 1-D）。图 1-E 和图 1-F 的结果显示，糙米酵素的差异代谢物中脂质（76 种）、碳水化合物及其衍生物（48 种）、氨基酸 及其衍生物（44 种）等植物初生代谢产物和萜类化合物（100 种）、甾体及其衍生物（33 种）等植 物次生代谢产物发生显著变化（P＜0.05）。与未糙米酵素相比，糙米酵素中的乙酰氨基葡萄糖、羟 基白藜芦醇苷、黄麻属醇苷 A、N-乙酰-β-氨基葡萄糖、土霉素、新岩蛤毒素、去乙酰异戊酸酯、刀豆 苷等代谢物的差异贡献度较高（图 1-G）。有研究表明，羟基白藜芦醇苷作为苦艾草（Artemisia absinthium）的主要成分之一，具有抗寄生虫和抗氧化的作用。因此，本研究推测上述差异代谢物 可能是糙米酵素改善肠道健康的重要功能物质基础。

为进一步评价糙米酵素对生物体肠道健康的调节作用，本研究通过便秘斑马鱼模型探究糙米酵素 对肠道运动的改善作用。便秘斑马鱼模型对糙米酵素的最大耐受剂量实验结果显示当糙米酵素的暴露 质量浓度为 125~1 000 μg/mL 时，斑马鱼生活正常；升高到 2 000 μg/mL 后会导致斑马鱼出现死亡 （死亡率 17%，表 2），说明斑马鱼对糙米酵素的 MTC 为 1 000 μg/mL。

图 2 尼罗红染色的结果显示，糙米酵素可以促进斑马鱼肠道内尼罗红染料的排出。随着糙米酵素 的处理质量浓度从 500 μg/mL 增加至 1 000 μg/mL，其肠道的荧光强度减弱（图 2-A）。图 2-B 显 示，500 μg/mL 的糙米酵素处理下，处理组与模型对照组对尼罗红染料的排出无显著差异（P＞ 0.05），但显著高于正常对照组和阳性对照组（P＜0.01）；当糙米酵素质量浓度提高到 750 μg/mL 时，与模型对照组相比，处理组的荧光强度显著降低了 26.7%（P＜0.01），与正常对照组达到同一水 平，差异不显著（P＞0.05）；当处理质量浓度进一步提高到 1 000 μg/mL 时，与模型对照组相比，处理组的荧光强度显著降低了 30.0%（P＜0.01），但与正常对照组和 750 μg/mL 糙米酵素处理组的差异 均不显著（P＞0.05）。而与阳性对照组相比，阳性对照组的荧光强度显著降低了 36.7%，甚至显著低 于正常组（P＜0.05）。上述结果表明糙米酵素能够有效促进便秘斑马鱼模型的肠道运动，且相较于多潘立酮，糙米酵素的干预便秘的效果更温和，可接近于正常水平。而后本研究又将样品质量浓度降低至 655 μg/mL 后，对比便秘模型组，预防便秘功效得到了显著性改善（P < 0.001），推测糙米酵素 具有预防斑马鱼便秘模型功效最低起效质量浓度在 655 μg/mL 左右。

此外，图 3-G 显示，糙米酵素干预后，拟杆菌门拟杆菌属（Bacteroides）、放线菌门双歧杆菌属 （Bifidobacterium）、厚壁菌门乳杆菌属（Lactobacillus）和粪杆菌属（Faecalibacterium）的相对丰度 显著升高（P＜0.05）。研究表明，Bacteroides、Bifidobacterium、Lactobacillus、Faecalibacterium 在 维持肠道正常功能、改善人体炎症性肠病等肠功能障碍发展中发挥着积极作用，可增强机体肠道消化 能力和屏障功能，改善便秘，降低炎症反应及感染风险。同时，糙米酵素干预伴随变形菌门大肠 杆菌-志贺氏菌属（Escherichia-Shigella）等促炎性细菌相对丰度的显著降低（P＜0.05），表明糙米酵 素能够一定程度上改善肠道菌群失调，有助于调节人体肠道菌群的组成结构，对肠道健康具有积极作用，这可能与糙米酵素中含有膳食纤维、花青素、酚类、黄酮类等功能成分有关，而发酵处理更好地 保持了糙米中酚类、黄酮类以及花青素水平。总的来说，糙米酵素是一种有前途的饮食干预策略。

结论：

本研究探究了糙米酵素调节肠道健康的功效评价并挖掘其作用机制。结果表明，糙米经过发酵处 理后代谢差异显著（P < 0.05），506 个差异代谢物中，415 个代谢物均为上调，包括脂质、碳水化合 物及其衍生物、氨基酸及其衍生物等植物初生代谢产物，以及萜类化合物、甾体及其衍生物等植物次 生代谢产物，是有益于肠道健康的功能物质基础；通过便秘斑马鱼模型验证得到，糙米酵素可通过下 调斑马鱼 nos1、nos2a 和 nos2b 基因的表达，提高便秘斑马鱼 NO 的清除率，从而促进斑马鱼的肠道 运动达到正常水平，相较于多潘立酮更温和；经过人体外模拟结肠厌氧发酵分析验证，糙米酵素还可 通过调节人体肠道菌群的组成结构丰富人体肠道微生物组成。因此，糙米酵素能够温和地调节肠道运 动，丰富肠道微生物组成，改善有益菌结构及肠道微生态，为开发相关健康产品提供理论依据。

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