多囊卵巢综合征为育龄期女性最为常见的生殖内分泌疾病，全球发病率为10%～15%[1]，持续性无排卵、高雄激素血症、胰岛素抵抗为该疾病的主要特征。性激素类药物及胰岛素增敏剂等对症治疗的合理应用可有效改善患者生殖功能，平衡糖脂代谢水平，预防子宫内膜癌、2型糖尿病、心血管疾病等远期并发症的发生[2-4]。但多囊卵巢综合征的异质性使针对病因的治疗作用局限，因此，积极寻求针对多囊卵巢综合征病理机制的辅助药物具有重要意义。

褪黑素是松果体由色氨酸合成的神经激素，是一种广谱抗氧化剂，具有调整昼夜节律、清除自由基、抗血管生成、抗炎和调节免疫功能的作用[5-7]。褪黑素通过其在下丘脑、垂体和卵巢中的受体影响女性生殖内分泌系统[8]，在排卵过程中卵泡会产生活性氧，女性卵泡液中的褪黑素浓度随卵泡成熟而升高，推测褪黑素可能通过抗氧化应激来促进卵泡成熟[9]。多囊卵巢综合征患者卵泡液中褪黑素水平明显低于健康女性[10]，已有临床研究表明外源补充褪黑素可促进多囊卵巢综合征患者卵母细胞发育，提高患者辅助生殖的化学妊娠率[11-12]，增强血浆抗氧化能力，改善机体炎性状态，并能降低雄激素、胰岛素与胆固醇水平，调整月经周期，有效调节多囊卵巢综合征患者的代谢与生殖功能[13-16]。但褪黑素作用于多囊卵巢综合征的药理机制及生物学过程尚不明确。网络药理学可系统整体展示药物活性成分与疾病靶点间的复杂作用[17]，本文基于网络药理学的方法探讨褪黑素对多囊卵巢综合征的作用靶点及治疗机制，旨在为进一步的药物研发及临床应用提供依据。

1方法

1.1褪黑素相关靶点筛选

使用PubChem数据库（https://pubchem. ncbi.nlm.nih.gov/）[18]，以melatonin为关键词，获取褪黑素的Canonical SMILES信息和3D结构；将褪黑素的SMILES上传到Swiss Target Prediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）数据库[19]，选择物种为Homo sapiens，将褪黑素的3D结构上传到Pharm Mapper网站（http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）[20]，目标集选Human Protein Targets Only (v2010, 2241)，同时检索DrugBank（https://go.drug bank.com/）[21]和TCMSP（https:// tcmspw.com/tcmsp.php）[22]数据库，在TCMSP数据库中检索类别选择Chemical name。将得到的靶点信息汇总后使用UniProt数据库（https://www. uniprot.org/）对靶点名称进行规范，校正为官方名称。校正后使用Excel表格去重，得到褪黑素的作用靶点。

1.2多囊卵巢综合征相关靶点筛选

多囊卵巢综合征相关靶点筛选以polycystic ovary syndrome为关键词，在GeneCards（https:// www.genecards.org/）、OMIM数据库（http://www. omim.org/）、DisGeNET数据库（https://www. disgenet.org/）[23]中进行筛选，选择物种为Homo sapiens，为提高结果的可信度，在DisGeNET中设置基因–疾病关联评分（GDA）≥0.3，GeneCards中设置相关性评分阈值为10筛选多囊卵巢综合征相关靶点，整合汇总后去重获得疾病相关靶点。

1.3靶点蛋白相互作用（PPI）网络构建

将褪黑素与多囊卵巢综合征的靶点使用维恩图工具（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/ index.html）取交集，获得褪黑素与多囊卵巢综合征的共同靶点。将共同靶点上传至String 11.5平台（https://string-db.org/）[24]，选择物种为Homo sapiens，设定置信度大于0.9，为高置信度。隐藏网络中断开连接的节点，获得靶点PPI网络。网络中的节点（nodes）代表靶蛋白，边（edges）代表靶蛋白与靶蛋白之间存在相互作用。度（degree）值为网络图中节点的连接数量，degree值越高该节点在网络中越重要。将PPI网络导出为tsv格式文件，导入Cytoscape 3.7.1软件（https://cytoscape.org/）使用Cytohubba插件根据度值使用MCC算法筛选核心靶点。

1.4基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析

使用R语言软件及Bioconductor插件[25]进行GO和KEGG信号通路富集分析，导入交集靶点，使用Cluster Profiler等处理数据，以P＜0.05为标准[26]。

1.5分子对接模拟

将褪黑素与PPI网络中degree值排名最高的10个靶点进行分子对接，以验证其与核心靶点的结合强度。使用RCSB蛋白质数据库（http://www. rcsb.org/）获取蛋白质受体的晶体结构，使用PyMol 2.4.0预处理下载的蛋白质结构，去除原始配体、溶剂分子、多余的蛋白质链并添加极性氢。使用AutoDock Tools 1.5.6计算Gasteiger并根据天然配体确定对接框的中心和大小[27]。使用MMFF94s力场通过极性氢化和能量最小化处理MT的3D结构。用AutoDock Tools 1.5.6将所有蛋白质和褪黑素的结构转换为PDBqt格式，使用AutoDock Vina通过分子对接评估褪黑素与中枢靶点的结合[28]。计算出的结合亲和力，并使用PyMol 2.4.0软件可视化对接结果。

2结果

2.1褪黑素、多囊卵巢综合征靶点的获取

褪黑素靶点合并去重后共获得377个作用靶点，将从GeneCards、OMIM、DisGeNET数据库中获得的多囊卵巢综合征相关靶点合并去重后得到1 870个靶点。

2.2褪黑素治疗多囊卵巢综合征的PPI网络

将褪黑素作用靶点与多囊卵巢综合征相关靶点使用维恩图工具求交集，获得共同靶点109个，见图1。将褪黑素治疗多囊卵巢综合征的109个交集靶蛋白导入String 11.5数据库得到PPI网络图，见图2。该PPI网络共有108个节点，314条边，平均节点度5.81。将PPI网络图导入Cytoscape 3.7.1软件，使用Cytohubba插件进行网络拓扑分析，节点颜色越深度值越高，即与更多的节点发生相互作用，见图3。结果显示，褪黑素治疗多囊卵巢综合征度值排名前10的靶点依次为SRC、PIK3R1、PIK3CA、EGFR、HRAS、RHOA、ERBB2、IGF1、MET、JAK2。

2.3GO和KEGG通路富集分析

使用R语言的ClusterProfiler包对109个目标靶点进行GO和KEGG通路富集分析，GO富集分析包括细胞组成（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）、生物过程（biologicalprocess，BP）3个部分。根据靶点计数，选择每个部分显著富集的前10项，使用R软件包的ggplot2将结果进行可视化，见图4。富集的GO功能主要包括腺体发育、磷脂酰肌醇介导信号素、蛋白激酶B信号传导等。KEGG通路富集分析，将筛选后的前20条富集信息制成气泡图，见图5。进一步使用Cytoscape 3.7.1构建了关键靶点–信号通路网络，见图6。富集的主要KEGG通路包括黏着斑、胰岛素信号通路、趋化因子信号通路、孕酮–介导卵母细胞成熟、ErbB信号通路、神经营养素信号通路、血管内皮生长因子信号通路等，见表1。

2.4分子对接

选择10个核心靶点与褪黑素进行分子对接。本研究设定结合自由能小于−5.0 kcal/mol（1 J＝4.4 kcal）代表结合具有显著性，以此佐证活性成分与核心靶点之间作用关系的可信度，将对接结果进行可视化展示，见图7。

如表2所示，除IGF1、SRC外，其余靶标与褪黑素的亲和力均低于−5.0 kcal/mol，表明褪黑素与多囊卵巢综合征潜在靶点有较好的亲和力。

3讨论

根据本研究结果发现SRC、PIK3R1、PIK3CA、EGFR、HRAS、RHOA、ERBB2、IGF1、MET、JAK2在褪黑素改善多囊卵巢综合征方面发挥着重要的作用。其中PIK3R1、PIK3CA、EGFR、HRAS、RHOA、ERBB2、MET、JAK2基因和褪黑素的分子对接表现出高亲和力，表明这8个基因与褪黑素对多囊卵巢综合征的治疗作用高度相关。

PIK3R1、PIK3CA与磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylin-ositol-3-kinase，PI3K）家族相关，PI3K依据结构特征分为I、II和III 3类[29]。I类进一步分为IA和IB亚组，IA类PI3K由p110催化亚基和p85调节亚基的异二聚体组成[30]。在哺乳动物中，p85由PI3K调节亚基PIK3R1、PIK3R2和PIK3R3编码，p110由PI3K催化亚基PIK3CA、PIK3CB和PIK3CD编码[31]。蛋白激酶B（Akt）是PI3K信号传导中重要的下游效应器，可抑制细胞凋亡、刺激依赖性细胞生长和调节细胞代谢[32]，PI3K-Akt信号通路在调节多囊卵巢综合征患者胰岛素抵抗、脂肪细胞分化和卵泡生长机制中起着非常重要的作用[33]，已有研究表明褪黑素可通过PI3K-Akt通路改善多囊卵巢综合征大鼠模型的排卵障碍[34]。

EGFR属酪氨酸激酶型受体，参与胚胎植入与蜕膜等重要生殖过程[35]，其影响卵巢颗粒细胞的增殖和凋亡[36]，诱导卵母细胞的分裂与成熟[37]。与非多囊卵巢综合征患者的卵母细胞相比，多囊卵巢综合征患者卵母细胞中的EGFR在发育的GV阶段显著下调，进而导致更多未成熟卵泡的产生[38]。有研究发现，褪黑素可以上调EGFR的表达水平，有效促进体外卵母细胞的成熟[39]。

RHOA是GTP酶Rho族的成员[40]，RHOA参与调节胰岛素分泌[41]，其通过胰岛素受体底物1的丝氨酸磷酸化造成胰岛素信号受损[42]，可能与多囊卵巢综合征患者的胰岛素抵抗相关。Fbxl7通过泛素化降解RHOA，增强胰岛素信号通路，而褪黑素能上调小鼠肝脏中因辅助生殖而降低的Fbxl7表达，改善辅助生殖小鼠后代的葡萄糖代谢受损[43]。

细胞自噬在多囊卵巢综合征相关代谢紊乱的发病机制中有潜在作用，在患多囊卵巢综合征的患者和大鼠卵巢组织中的自噬增强。相关基因ERBB2、EGFR可能高度参与多囊卵巢综合征中与自噬相关的细胞过程[44]，研究表明褪黑素可以通过减少自噬延缓卵巢衰老[45]。

MET也称MNNG HOS转化基因，是编码肝细胞生长因子（HGF）受体酪氨酸激酶c-MET的原癌基因[46]。HGF/c-MET信号参与调节包括卵泡膜生长及颗粒细胞凋亡等卵泡发育的各重要阶段[47]，1项对包括21名接受辅助生殖治疗的多囊卵巢综合征患者的研究表明，HGF/c-MET信号通路的传导可能是受精成功的关键因素[48]，褪黑素可以上调HGF/c-MET系统而抑制动脉粥样硬化兔子的巨噬细胞的浸润[49]。

JAK2属非受体型酪氨酸蛋白激酶家族，JAK2/STAT3信号通路是参与瘦素细胞内信号转导的主要调控通路，多囊卵巢综合征患者血清瘦素的水平显著高于排卵周期正常的健康女性[50]，多囊卵巢综合征大鼠血清JAK2和STAT3的磷酸化水平显着增加[51]，研究证明褪黑素可以通过抑制JAK2/STAT3信号通路而减少氧化应激损伤，保护内皮细胞[52]。

HRAS属于RAS基因家族，是RAS/RAF/MEK/ ERK/MAPK通路的上游调控因子，在多囊卵巢综合征患者中，血清HRAS表达与患者体质量指数、空腹血糖、空腹胰岛素等代谢特征相关[53]，目前尚未有褪黑素直接通过HRAS靶点改善多囊卵巢综合征的报道，但基于研究结果，推测褪黑素可以通过其在治疗多囊卵巢综合征中发挥有益作用。

GO富集分析结果表明，褪黑素治疗多囊卵巢综合征的靶点富集最显著的生物学过程是腺体发育、磷脂酰肌醇介导信号素、蛋白激酶B信号传导等，KEGG通路主要富集于黏着斑、胰岛素信号通路和趋化因子信号通路。黏着斑与细胞基底层紧密连接以促进细胞与外界环境的联系，有研究表明褪黑素水平的升高可以触发黏着斑局部黏附，促进颗粒细胞的黄体化，导致胚胎植入增强[54]。胰岛素信号通路缺陷与多囊卵巢综合征患者的胰岛素抵抗、高雄激素血症和无排卵高度相关[55-57]，治疗药物二甲双胍可调节胰岛素信号通路中传导蛋白质的表达从而改善多囊卵巢综合征相关症状[58]，褪黑素可触发胰岛素受体及其细胞内底物的磷酸化而动员胰岛素信号传导途径[59]。趋化因子有管理白细胞群迁移的特性，白细胞或在排卵、黄体化和黄体溶解中发挥重要作用，治疗药物二甲双胍即可通过AMPK依赖性途径减少趋化因子介导的炎症反应，从而促进颗粒细胞功能[60]。动物实验发现，褪黑素可通过抑制内皮趋化因子和黏附因子从而减少小鼠肺中巨噬细胞的数量[61]，作用于以上通路可能为其治疗多囊卵巢综合征的内在机制。

综上所述，以上结果探讨了褪黑素治疗多囊卵巢综合征的分子机制，展示出其以多环节、多靶点、多途径方式对多囊卵巢综合征患者生殖内分泌的调节作用，以期为进一步研究提供思路。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献（略）

来  源：郁悦，陈彤，刘新敏．基于网络药理学和分子对接探讨褪黑素治疗多囊卵巢综合征的作用机制  [J]. 现代药物与临床, 2022, 37(10): 2197-2205 .